¿Qué es la cromatografía líquida?

Hay dos tipos de cromatografía: la cromatografía de gases, que separa los componentes volátiles de una muestra, y la cromatografía líquida, que separa moléculas neutras de pequeño tamaño en disolución. De ambas soluciones de separación, la cromatografía líquida (CL) es el método que se aplica con mayor frecuencia.

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Funcionamiento de la cromatografía líquida

La cromatografía líquida es una las técnicas de cromatografía más ampliamente utilizada para separar las moléculas de una muestra (soluto), que se diluye en un solvente llamado fase móvil. La separación se lleva a cabo sobre la base de las interacciones moleculares entre sus propias moléculas y la fase estacionaria (sustrato).
La cromatografía líquida utiliza la permeación en un gel, o bien el intercambio iónico. La permeación en gel consiste en separar las moléculas según su tamaño y el método de intercambio iónico consiste en separar las partículas según su carga.
La separación se puede realizar en una columna o en una lámina, con una fase móvil líquida y un soporte sólido como fase estacionaria. Los revestimientos interiores de la columna pueden ser muy diferentes dependiendo de lo que se desee analizar dadas las interacciones entre el componente y la muestra.
La fase móvil se desplaza a lo largo de la fase estacionaria, arrastrando consigo los componentes de la muestra que se separan durante la cromatografía. En la CL, la interacción entre las moléculas de la muestra y el medio cromatográfico depende de varios factores como el tamaño, la carga, la unión por afinidad, la adsorción o la hidrofobicidad.
La cromatografía líquida se utiliza para separar (separación molecular) compuestos solubles poco sensibles al calor (proteínas, etc.). Por ello, se aplica principalmente en laboratorios de farmacia o investigación.

Tipos de cromatografía líquida

Hay varios tipos de cromatografía líquida:

Cromatografía líquida: CL.
Cromatografía líquida con detección mediante espectrometría de masas: CL/EM
Supercrítica: este método utiliza las propiedades del CO2 que, en determinadas condiciones de presión y temperatura (>31 °C y >73 b), se convierte en solvente.

Formas avanzadas de CL

La cromatografía líquida de alta resolución o cromatografía líquida a alta presión (HPLC) es una forma avanzada de CL. Esta utiliza una alta presión (20-150 b) para forzar el paso de la muestra a través de la columna y así ganar velocidad, reducir el umbral de detección y mejorar la fiabilidad y precisión. Actualmente la cromatografía líquida es una de las técnicas de análisis cuantitativo más utilizadas con aplicación en los laboratorios analíticos y en la industria farmacéutica.

Fiabilidad y versatilidad de la CL-EM

La cromatografía líquida acoplada a detectores de espectrometría de masas es un método de análisis químico que combina ambas tecnologías. Aporta versatilidad (detección de una gama más amplia de moléculas) y eficiencia (por ejemplo, moléculas muy complejas) para identificar y/o cuantificar con precisión muchas sustancias. Esta tecnología, inicialmente cara, tiende a hacerse más asequible y es flexible.

Cromatografía supercrítica sin solvente químico

Esta técnica utiliza como solvente el CO2, un gas que se convierte en solvente en condiciones de temperatura superiores a 31 °C y a una presión de 73 bar. La cromatografía líquida con CO2 aporta todas las ventajas de un solvente clásico y es más respetuosa con el medio ambiente. La muestra se diluye en la fase líquida y está rápidamente disponible en la fase gaseosa para una mayor eficiencia. A diferencia del uso de un solvente convencional, no es necesario realizar ningún paso adicional de eliminación del solvente por barrido con nitrógeno.

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Diferencia entre la cromatografía líquida y de gases

Como su nombre indica, y a diferencia de la cromatografía de gases, la cromatografía líquida utiliza como soporte una fase móvil líquida. Normalmente, los líquidos son mezclas de solventes de polaridades compatibles, mientras que en la cromatografía de gases la fase móvil es un solo gas de alta pureza.

Cromatografia supercrítica sem solventes químicos

En la siguiente tabla se indican otras de las muchas características que diferencian estos dos métodos:

Cromatografía líquida	Cromatografía de gases
La fase móvil es un líquido.	La fase móvil es un gas.
La separación se basa en la interacción del soluto con el medio cromatográfico.	La separación se basa principalmente en los puntos de ebullición de las moléculas del soluto.
Se utiliza para separar cualquier compuesto soluble, por ejemplo, aminoácidos, proteínas, fármacos, ácidos nucleicos, lípidos, antioxidantes, carbohidratos y polímeros naturales y artificiales.	Se aplica a la separación de compuestos volátiles y ezclas de gases.
Esta técnica se suele realizar a temperatura ambiente y permite analizar compuestos sensibles al calor de manera segura.	Si se realiza a temperaturas más altas, las sustancias térmicamente sensibles pueden desnaturalizarse.
Esta es una técnica elativamente lenta.	El análisis es más rápido y tarda unos pocos minutos, aunque pueden ser tan solo unos segundos.
Utiliza solventes líquidos polares* como agua o metanol. *moléculas con diferentes polaridades en sus componentes	Utiliza cualquier solvente que se evapore.

Gases para cromatografía

Gases utilizados en estas tecnologías

En el caso de la CL-EM o la HPLC-EM, el uso de un detector MSL requiere un flujo de nitrógeno para eliminar eficazmente el solvente de la muestra antes del paso de identificación y cuantificación en el detector. Puesto que una CL-EM normalmente consume 10 m3/día, es decir, el equivalente a una botella de 50 litros, el laboratorio dispone de diversas soluciones en función del número de CL-EM y su tasa de uso:

Botellas o bloques con unidad de inversión.
Recipiente de líquido con evaporador.
Generador de nitrógeno in situ. Esta solución es posible dada la calidad de nitrógeno requerida por el fabricante del analizador (alrededor de N30, es decir, una pureza del 99,9 %). El uso de un generador de nitrógeno es habitual y cómodo. Este equipo requiere mantenimiento, por lo que es muy recomendable disponer de una solución de respaldo con botellas y un sistema de red de gas.

La cromatografía líquida supercrítica utiliza CO2 (calidad Alphagaz SFC - 99,998 %) suministrado en forma líquida en varios formatos en función de los volúmenes necesarios: